BBM Magazine Issue-Sayı: 55 August - Ağustos 2022

62 ARTICLE • MAKALE BBM / AĞUSTOS 2022 • AUGUST 2022 Sigma, while the lipase (~200 U/g) from Aspergillus niger was obtained from BioChemics. Peroxidase from horserad- ish (232-668-6) was purchased from BBI Enzymes (UK). The petroleum ether (32247) used for lipid extraction was sup- plied by Honeywell, Riedel-de Haen. All other chemicals used in the laboratory were of analytical grade. 2.1. Protein Extraction Process The extraction of proteins was performed in 0.1 M acetate buffer pH 5.3 with 5 g of wheat flour in an Erlenmeyer flask, followed by incubation at room temperature for a specific time with horizontal shaking at 300 rpm. Afterwards, cen- trifugation at 8000 rpm was performed for five minutes. To optimize the extraction process, three different combi- nations of centrifugation and filtration were performed, to obtain the highest value of protein concentration. The first sample was, thus, filtered through a filter with a pore size of 0.45 µm. For the second sample, additional centrifugation was performed under the same conditions (8000 rpm, five minutes). In the third sample, the supernatant was decanted after the first centrifugation. For all three combinations, the supernatant was separated and considered as a crude pro- tein extract. The protein concentration was determined in the supernatant according to the Bradford method. Each sample was assayed twice, and three individual absor- bance measurements per extracted sample were recorded within an experimental error of about 0.03%. 2.2. scCO2 Medium Treatment An application of scCO2 technology was implemented to determine the effects of scCO2 on enzymes’ activities. First, the native enzymes were exposed to scCO2 under different conditions in a high-pressure batch reactor, and then white wheat flour was exposed to the scCO2 medium under the same conditions. A high-pressure batch reactor with a volume of 60 mL with a CO2 gas supply was used in the experimental research. When the temperature in the high-pressure batch reactor reached 35 °C, the pressure was raised to the desired value of 200 and 300 bar with cooled CO2. Afterwards, the system was maintained at a constant temperature and pressure for a preestablished exposure time. After the scCO2 medium treatment, the re- actor was depressurized rapidly (0.37 ± 0.08 bar/min). Later, enzymes were extracted from the scCO2 treated wheat flour, where the supernatant was used to determine the en- zyme activity and protein concentration. Residual enzyme activities in the treated wheat flour were correlated to the enzyme activities in untreated wheat flour, taken as 100%. The flour samples were subjected to the same conditions of scCO2 treatment for three times to ensure repeatability, whereby the percentage error was ±2.0%. 2.3. Flour Physicochemical Analyses çavdar unu tip 1250, tam tahıllı çavdar unu, graham unu ve kepekli buğday unu Hlebček, d.o.o. (Pra- gersko, Slovenya). Deneyler, Messer, Ruše tarafın- dan üretilen karbon dioksit (%99,5 saflık) kullanılarak yapıldı. Etanol (%96), fosforik asit (≥%85), sodyum klorür (≥%99,5), Coomassie-Brilliant Blue G250 (1.15444.0025) ve asetonitril (%99.9) Merck'ten, sığır serum albümini (≥ %96), sodyum asetat (≥99.0%), asetik asit (analiz için GR), p-nitrofenil butirat (≥ %98) Sigma'dan sağlandı. Aspergillus oryzae'den a-amilaz (~30 U/mg) ve Aspergillus saitoi'den prote- az (≥0,6 U/mg) enzimleri BioChemics'ten elde edil- miştir. Horseradish'ten (232-668-6) peroksidaz, BBI Enzymes'ten (İngiltere) satın alındı. Lipid ekstraksi- yonu için kullanılan petrol eteri (32247), Honeywell, Riedel-de Haen tarafından sağlandı. Laboratuvarda kullanılan diğer tüm kimyasallar analitik saflıktaydı. 2.1. Protein Ekstraksiyon Süreci Proteinlerin ekstraksiyonu, bir Erlenmeyer şişesi içinde 5 g buğday unu ile pH 5.3 olan 0.1 M ase- tat tamponu içinde gerçekleştirildi, ardından 300 rpm'de yatay çalkalama ile oda sıcaklığında belirli bir süre inkübe edildi. Daha sonra 8000 rpm'de beş dakika santrifüj işlemi gerçekleştirildi. Ekstraksiyon sürecini optimize etmek için, en yüksek protein kon- santrasyonu değerini elde etmek için üç farklı sant- rifüjleme ve filtrasyon kombinasyonu gerçekleştiril- miştir. Böylece ilk numune, 0.45 um'lik bir gözenek boyutuna sahip bir filtreden süzüldü. İkinci numune için, aynı koşullar altında (8000 rpm, beş dakika) ek santrifüj gerçekleştirildi. Üçüncü örnekte, birin- ci santrifüjlemeden sonra süpernatant dökülmüştür. Her üç kombinasyon için de süpernatan ayrıldı ve ham protein özütü olarak kabul edildi. Protein kon- santrasyonu, süpernatanda Bradford yöntemine göre belirlendi. Her numune iki kez test edildi ve ekstrakte edilen numune başına üç ayrı absorbans ölçümü, yaklaşık %0.03'lük bir deneysel hata içinde kaydedildi. 2.2. scCO2 Orta Arıtma scCO2'nin enzimlerin aktiviteleri üzerindeki etki- lerini belirlemek için bir scCO2 teknolojisi uygula- ması uygulandı. İlk olarak, doğal enzimler, yüksek basınçlı bir kesikli reaktörde farklı koşullar altında scCO2'ye maruz bırakıldı ve ardından beyaz buğ- day unu, aynı koşullar altında scCO2 ortamına ma- ruz bırakıldı. Deneysel araştırmada CO2 gaz besle- meli 60 mL hacimli yüksek basınçlı kesikli reaktör kullanılmıştır. Yüksek basınçlı kesikli reaktördeki sıcaklık 35 °C'ye ulaştığında, soğutulmuş CO2 ile